干货|一文搞定干细胞培养全流程（基质胶）
2026-02-06干细胞（Stemcells）是指未分化的或部分分化的细胞，具有再生各类组织器官的潜在功能，被称为“万用细胞”。干细胞研究已成为重要的科研方向，在疾病治疗、创伤修复等多个领域发挥重要作用。今天我们就以人胚胎干细胞（hESC）为例，带大家了解利用基质胶培养干细胞的整个流程。
一、复苏
详细步骤如下：
稀释前将Arcegel基质胶（hESC验证， LDEV）和适量体积的DMEM/F12培养基 放入4℃冰箱过夜融化。
2.混匀
将融化的Arcegel基质胶（hESC验证，无LDEV）和DMEM/F12从冰箱取出，用预冷的10ml移液管吸取适量DMEM/F12加入装有Arcegel基质胶（hESC验证，无LDEV）的容器中混匀，4℃保存，1个月内使用，-20或-80℃可保存半年以上。
3.稀释
吸取适量稀释的Arcegel基质胶（hESC验证，无LDEV）（稀释比例按1:80-1:160，浓度约为10mg/ml）置于6孔板中，轻轻摇晃，使Arcegel基质胶（hESC验证，无LDEV）均匀平铺于孔板底部，培养箱放置1h以上，种细胞前弃掉，之后每次传代也要先培养器皿内铺胶包被。
4.复苏
将hESC细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之复苏，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
5.离心
将冻存管内细胞悬液转移至含3-4ml的hESC完全培养液的15ml离心管内，以1000rpm离心5min。
6.吹打
离心后将上清液吸除，轻弹离心管底，使细胞沉淀松散，加入新鲜的hESC完全培养液2-3ml，轻轻吹打一次使细胞克隆块悬浮。
7.转移
转移至已经铺好Arcegel基质胶（hESC验证，无LDEV）的6孔板中培养。
8.换液
复苏第二天不换液，第三天起每天更换hESC细胞完全培养液。
复苏时不能吹打过度，不能吹打成单细胞，保持细胞克隆块状，复苏后48小时换液，期间最好不要挪动细胞。hESC复苏后可能4-5天才开始有克隆出现，7-10天传代（具体视克隆密度和大小而定）。
二、传代及培养
详细步骤如下：
一般在复苏后第7-10天传代，之后为6-7天一次。
2.冲洗
吸除废液。用DPBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
3.消化
加入2-3ml的1mg/ml的干细胞专用消化液至培养瓶，轻轻晃动，使之覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。
4.脱落
显微镜下观察，直至细胞克隆脱落（一般需要3-6min）。
5.转移
将带有脱落细胞克隆的消化液转移至15ml离心管中，放置一会，待细胞克隆自然沉降后将上层吸除，加入hESC完全培养液3ml轻轻混匀，放置一会，待克隆自然沉降后将上层培养液吸除，重复一次（即hESC完全培养液漂洗2遍，沉降后吸掉上清）。
6.传代
加入hESC完全培养液3ml，用1ml移液器吹打2-3次，将克隆块吹散成大小为原来的约1/10（若想得到大小较均一的克隆块，此时可将细胞静置片刻，待细胞自然沉降后取悬浮于液体中间层的克隆块传代），传代比例根据母瓶克隆密度和大小而定，一般1:3-1:5传代（注意：传代时不能吹打过度，不能吹打成单细胞，保持细胞克隆块状，传代后48小时换液，期间最好不要挪动细胞）。传代后放入37℃培养箱培养。
7.挑除
第二天不换液，第三天起每天换液，换液前显微镜下将分化的克隆挑除。
8.培养
继续培养，每6-7天传代一次。
三、冻存
详细步骤如下：
按传代的方法将细胞消化下来，漂洗后细胞沉于离心管底部（上述传代中步骤5）。
2.冷冻
冷冻比例根据母瓶克隆密℃和大小而定，一般1个T25培养瓶可冷冻1-3个冻存管。向离心管内加入1/2冷冻体积的hESC完全培养液，轻轻混匀。
3.加液
逐滴加入已经预冷（4℃）的细胞冻存液（推荐使用Cell Freezing Medium, Serum-Free无血清细胞冻存液），一边加一边轻轻晃动离心管。
4.标记
1ml移液器轻轻混匀细胞（保持克隆块，不可吹打过度），每支冻存管内加入500ul-lml细胞悬液，标记细胞信息。
5.转入
将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮（如使用Cell Freezing Medium, Serum-Free无血清细胞冻存液，则不需要程序降温盒）。
图 hESC培养结果示意图
这就是干细胞培养的全部流程了。怎么样？今天的知识你掌握了吗？相信以后再遇到干细胞培养问题，大家就不会犯难啦！
