saRNA复制机制与生产工艺

二、saRNA的生产和递送

虽然saRNA有着显著的成本与安全性优势，但是由于其自身的结构特征，也给生产带来了新的挑战。由于saRNA将编码RNA聚合酶的序列与表达目标蛋白的序列连接在一起，导致整个mRNA分子的分子量比传统的mRNA要大得多(～10kb)，也要复杂得多(含有更多二级结构)，这大大增加saRNA在体外转录反应时的难度，降低saRNA生产时的产量和纯度。因此，saRNA生产在体外合成过程、分离纯化过程等方面也提出了更高的要求。分离纯化方式所采用的亲和层析纯化方式存在目标产物收率较低，完整性低等问题；并且多种层析色谱纯化操作联用(例如：增加纤维素层析、疏水反相层析等分离纯化方式)过程繁琐容易引入新的杂质、且回收率低，成本高等诸多困难。此外，现阶段大规模生产所用的IVT反应体系基本是从小RNA（<100 nt）的核酸序列的反应体系优化发展而来， 而自复制mRNA的大小高达10kb以上，导致无法直接适用，需要对现有的IVT反应体系进行优化。

体外转录RNA的合成工艺是在20世纪90年代建立的，主要使用噬菌体RNA聚合酶，现在是一个强大的和成熟的大规模生产合成RNA的工艺。酶促反应由噬菌体RNA聚合酶催化，用于研究目的的可生产毫克数量RNA的商业化体外转录试剂盒已存在数年。酶促反应由噬菌体RNA聚合酶催化，用于研究目的的可生产毫克数量RNA的商业化体外转录试剂盒已存在数年。除了聚合酶外，体外转录反应通常包括：具有启动子序列(约23个碱基)的线性化DNA模板，其对各自的聚合酶具有高结合亲和力；四种必需碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶)的核糖核苷酸三磷酸(rNTPs)；核糖核酸酶抑制剂使任何污染核糖核酸酶失活；一种降解焦磷酸盐的焦磷酸酶，它会抑制转录；MgCl2，提供Mg2+作为聚合酶的辅助因子以及pH缓冲液，其中还含有最佳浓度的抗氧化剂和多胺。如果利用共转录加帽则需要添加帽类似物作为转录的起始剂。

在体外转录反应过程中噬菌体聚合酶结合启动子序列以启动转录然后酶沿着模板向其5'末端移动，在行进过程中延伸RNA转录物。当酶从模板末端流出时就会发生转录终止（径流转录）。poly(A)尾部可以编码到DNA模板中也可以在转录后通过酶促方式添加。当体外转录反应完成时用DNase片段化DNA模板并使用多种方法回收RNA，包括沉淀或色谱法。体外转录反应中产生的RNA的质量和数量取决于许多因素，包括RNA转录本大小、模板浓度、反应时间和温度、Mg2+浓度和NTP浓度。通常这些条件需要对正在生成的每种类型的结构进行一些优化。

2021年Robin J Shattock[1]作为通讯作者在Cell & Molecular Biology发表的文章：《Design-of-experimentsin vitro transcription yield optimization of self-amplifying RNA》。本研究通过实验设计（DoE）方法优化了长saRNA（约9.4kb）的IVT过程，以产生最大RNA产量，并验证了不同大小RNA的最佳IVT条件。DoE实验结果发现，镁对RNA产量的影响最大，乙酸根离子比氯根离子更有效地提高RNA的产量。此外，镁和核苷三磷酸盐（NTPs）之间的相互作用对IVT非常重要。在IVT期间进一步添加乙酸钠（NaOAc）对RNA产量的增加无益。此外，焦磷酸酶对IVT生产不是必需的。最佳的IVT方法可用于合成不同长度的RNA。这些发现强调了通过IVT合成高质量和数量的saRNA的能力，并且每种组分的最佳量对于它们的相互作用以产生高RNA产量至关重要。

体外转录(IVT) mRNA可以通过使用基于重组牛痘病毒的加帽酶进行转录后修饰或在体外转录过程中添加帽类似物。酶加帽更复杂但产量要高得多；加帽效率接近100%，所有加帽结构均以正确的方向添加。酶加帽被用于大规模和实验室生产可以生产Cap0和Cap1结构。使用帽类似物的共转录加帽是制备IVT mRNA的另一种方法，其中在转录反应中过量提供帽类似物。与酶加帽反应相比该过程要简单得多但总收率往往较低，并且可以将各种加帽结构与更多样化的设计相结合。现在抗逆转帽类似物（ARCAs）已经规避了伪对称帽的历史问题，这导致大约70%的转录本的帽数为Cap0结构，而5′三磷酸的转录本则为30%。为了提高加帽效率引入了三聚体类似物如CleanCap，它采用了帽1结构。

saRNA疫苗的主要挑战是实现将saRNA充分递送到靶细胞或组织。saRNA构建体是相对较大(9000至15,000 nt)的阴离子分子，这阻碍了细胞对未配制的saRNA的有效摄取。尽管在一些研究中使用了“裸”saRNA，但已经出现了三种主要的递送平台：聚合物纳米颗粒、脂质纳米颗粒和纳米乳剂。这些递送策略有一个共同的重心，其中阴离子saRNA被阳离子(或可电离阳离子)载体浓缩成~100nm大小的纳米颗粒从而保护saRNA免于降解并鼓励摄取到靶细胞中(图4)。saRNA的脂质纳米粒制剂是目前最有效的，只需要10 ng的saRNA即可诱导强大的免疫反应。saRNA LNPs主要基于针对siRNA和mRNA递送而优化的配方，其中包括可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质。这些LNP已用于多种saRNA疫苗传染病适应症，包括新型冠状病毒、流感、狂犬病、弓形虫、呼吸道合胞病毒以及saRNA癌症疫苗的最新进展，包括黑色素瘤和结肠癌。Melo等人使用了基于阳离子脂质1，2-二油酰基-3二甲基铵-丙烷(DOTAP)的LNPs并在单次肌肉注射后显示出高滴度的gp120特异性抗体以及与蛋白质免疫相比抗原特异性生发中心B细胞水平的提高。

三、总结与展望

近年来，通过将整个序列拆分为单独分子中的nsP和GOI以及反式扩增RNA(taRNA)的应用，可以部分克服saRNA的大尺寸挑战。taRNA已被证明与saRNA一样有效表达，与saRNA相比，taRNA更安全，因为taRNA将编码RNA聚合酶的序列和表达目标蛋白的序列分开，可以提高RNA递送效率，降低saRNA的风险，而且taRNA长度较短更容易大批量制备。自复制RNA病毒包括alpha病毒（alphaviruses）、黄病毒（flaviviruses）、慢病毒（lentiviruses）等，基于以上复制子框架构建的自复制RNA(saRNA)具有低剂量高表达的优势，逐渐被开发用于mRNA疫苗、表达病原体抗原、癌症抗原或其他异源蛋白。