流式实验秘籍：3种巨噬细胞极化方案！
2025-05-15巨噬细胞极化
除了M1和M2型巨噬细胞，肿瘤微环境中还存在肿瘤相关巨噬细胞（TAM），主要表达CD163、CD206和Arg等标志物，促进肿瘤生长和转移。TAM分泌生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF），刺激血管生成并促进肿瘤细胞增殖；同时，它们产生免疫抑制细胞因子（如IL-10），抑制T细胞等抗癌免疫细胞的活性。此外，TAM还通过改变肿瘤细胞的新陈代谢，提供生长所需的营养和能量，成为肿瘤研究的重要亚群。
巨噬细胞的体外极化是研究其功能和分化的重要实验，通常使用外周血单核细胞进行。然而，由于原代细胞数量有限且分离困难，研究工作受到限制。因此，诱导THP-1细胞分化成为常用的替代方法。THP-1细胞来源于急性单核细胞性白血病患者，是一种高表达CD14的单核细胞系，广泛应用于巨噬细胞相关研究。
下面分享三种巨噬细胞极化方案
人外周血单核细胞M1/M2极化（仅供参考）
实验方案：
❶ 使用Ficoll从外周血中分离PBMCs。
❷ 通过CD14单核细胞磁珠分选试剂盒富集单核细胞，或将10-20 x 10⁶ PBMC种在2ml无血清培养基中，2-3小时后洗去未黏附细胞，获得约1 x 10⁶个单核细胞。
❸ 在6孔板中加入含M-CSF（50 ng/ml）的培养基，将单核细胞浓度调整为1-2 x 10⁶/ml，诱导分化为巨噬细胞。
❹ 3天后吸出1ml培养基，补充1ml新鲜培养基。
❺ 6天后诱导M1和M2极化，分别添加LPS（10 ng/ml）和IFN-γ（50 ng/ml）或IL-4（20 ng/ml），刺激18-20小时。
❻ 最后通过流式细胞术检测M1、M2相关Marker的表达。
人外周血单核细胞TAM极化（仅供参考）
肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤生长和转移中扮演重要角色。以下是一种利用肿瘤细胞来源的条件培养基诱导人单核细胞分化为肿瘤相关巨噬细胞的实验方法。
实验方案：
❶ 使用Ficoll从外周血中分离PBMCs。
❷ 通过CD14单核细胞磁珠分选试剂盒富集单核细胞。
❸ 利用流式细胞术检测单核细胞的纯度，确保纯度在95%以上。
❹ 将1 x 10⁶ CD14+单核细胞用1ml完全培养基重悬，种入24孔板。
❺ 制备肿瘤来源的条件培养基：将2.5 x 10⁵黑色素瘤细胞种在6孔板中培养过夜，洗净后加入1ml无血清培养基培养48小时，离心去碎片并过滤，定量至70 µg/ml。
❻ 从24孔板中取出500 µl培养基，加入500 µl肿瘤来源的条件培养基，诱导单核细胞分化为肿瘤相关巨噬细胞。
❼ 培养72小时后，通过流式细胞术检测肿瘤相关巨噬细胞。
THP-1向M1/M2极化
人单核细胞系THP-1的定向分化是研究巨噬细胞的重要体外模型。常用佛波酯PMA、粒细胞巨噬细胞刺激因子GM-CSF和巨噬细胞集落刺激因子M-CSF等细胞因子来激活THP-1细胞。
实验方案：
细胞培养：在RPMI-1640培养基中培养THP-1细胞，添加10% FBS。
诱导分化：使用25 nM的类维生素D3或phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）处理细胞，48小时。
M1/M2极化：
M1极化：添加IFN-γ和LPS，培养24至48小时。
M2极化：添加IL-4和IL-13，培养24至48小时。
检测：通过流式细胞术或qPCR分析极化后的细胞标志物。
巨噬细胞极化分为M1和M2两种状态，M1由IFN-γ和LPS刺激，具有促炎作用，M2由IL-4和IL-13诱导，主要具备抗炎和组织修复功能。两者在免疫反应及肿瘤微环境中发挥不同作用。在极化实验中，合理设计并选择合适的极化因子，使用空白、单染和生物学对照帮助区分M1/M2群体，结合流式细胞术检测标志物，确保数据准确。
