慢病毒包装操作流程

 

实验主要试剂

 

试剂名称	试剂来源
慢病毒包装细胞系293T	abm，LV010
2nd Generation Packaging System Mix	abm,LV003
Lentifectin™ Transfection Reagent	abm，G074
DMEM	Gibco
FBS	Gibco
Puromycin	abm,G264
ExCellenCT Lysis Kit	abm,G915
5X All-In-One RT MasterMix	abm,G592
EvaGreen 2X qPCR MasterMix	abm,G891

 

实验主要仪器

 

u 细胞计数板（XB.K.25）

u 倒置显微镜（OLYMPUS）

u 生物安全柜（Thermo）

u 二氧化碳培养箱（德国，Memment）SX-700

u 高速冷冻离心机：Thermo

u 显微镜（BX45-DP72.OLYMPUS）

 

实验流程

 

1、培养包装细胞

在进行转染前，提前两天将 1.3-1.5×106的abm 293T 细胞移入 10 cm细胞板进行培养，板内加入 10 ml 含 10% 热灭活胎牛血清的 DMEM 培养基，使细胞在进行转染时达到 70-80%融合率。在 5% CO2条件下，37℃培养细胞。

2、准备 DNA/LentiFectin慢病毒混合物

2.1 在1ml无血清培养基中加入10ug表达质粒和10ug的慢病毒转染辅助质粒、2nd Generation Packaging Mix，混匀，室温孵育5min。

2.2 将80ul的Lentifectin转染试剂稀释到1ml无血清培养基中，混匀，室温孵育5min。

2.3 将Lentifectin混合溶液加入到质粒混合溶液中，混匀，室温孵育20min后，再加入4.5ml的无血清培养基，即得到混匀的DNA/LentiFectin混合物。

3、转染包装细胞

将准备好的包装细胞293T中的培养基吸掉，加入DNA-LentiFectin复合物，轻柔涡旋平板使复合物分散。细胞在 CO2条件下，37℃过夜培养（8-14 小时），以加入 2-5%热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的新鲜 DMEM培养基更换旧培养基。

4、收获慢病毒

转染 48 小时后收集培养基，以 0.45 μm的低蛋白结合 PES 过滤膜过滤该培养基得到纯化的病毒液。以 10,000×g 离心4小时收集病毒颗粒，可获得浓缩的慢病毒。

 

滴度测定

采用荧光定量法测定病毒滴度，使用abm慢病毒滴度检测试剂盒(Cat No. LV900) 。

 

试剂组分	用量
Virus Lysis Buffer	800μl
Reagent-mix	1.0 ml
STD1 (Lentivirus Standard 1)	300μl
STD2 (Lentivirus Standard 2)	300μl

 

1、吸取2μl稀释好的病毒样品，加入18μl的病毒裂解缓冲液并在室温下孵育3分钟。病毒裂解物的Ct值将用于确定未知病毒样品的滴度。在此步骤中，病毒样品已稀释1:10; 因此在计算滴度时需要考虑该稀释倍数。

2、使用qRT-PCR法测定，试剂盒各组分及用量如下：

试剂组分名	病毒裂解液	标准物1（STD1）	标准物2（STD2）	阴性对照（NTC）
2X qPCR MasterMix	12.5ul	12.5ul	12.5ul	12.5ul
Viral Lysate	2.5ul	——	——	——
STD1	——	2.5ul	——	——
STD2	——	——	2.5ul	——
Reagent-mix	10ul	10ul	10ul	10ul

反应程序如下：

温度（℃）	时间（S）	循环数（次）
42	1200	1
95	600	1
95	15	40
60	60

 

结果： Titer of viral lysate = 5 x 107/23(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1)

Ctx = Average of 3 Ct values of the unknown sample

Ct1 = Average of 3 Ct values of STD1

Ct2 = Average of 3 Ct values of STD2

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