干货 | 肿瘤类器官免疫共培养：PBMC中T细胞激活扩增及TCE药效评价全流程
2026-04-23前言
类器官免疫共培养是评估肿瘤免疫治疗“药物”（例如TIL、CAR-T、PD-1/PD-L1抗体、TCE等）药效和毒性的重要系统。T细胞是加入共培养系统中常见的免疫细胞之一。在肿瘤类器官与免疫细胞共培养中，T细胞的来源，从免疫学原理角度，最优选为肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte, TIL）；其次是自体外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）；再次是异体PBMC；最后是T细胞细胞系。在实际操作中，同时获得肿瘤患者的类器官、PBMC甚至TIL的情况较少，因此，异体PBMC是肿瘤类器官免疫共培养更常用的T细胞来源。
PBMC中的T细胞可以使用CD3抗体和CD28抗体激活；T细胞激活后会有IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2等因子产生，细胞膜方面有CD69 和 CD25等分子上调。根据参考资料结合实验室经验，本文提供一种PBMC中T细胞激活的方法，并以IFN-γ的释放评估T细胞激活情况，T细胞激活后，可含有IL-2的无血清免疫细胞培养基中培养扩增。
主要实验材料
PBMC
CD3抗体
CD28抗体
免疫细胞培养基
IL-2
IFN-γ ELISA检测试剂盒
D-PBS
6孔板
15mL离心管
移液器及配套吸头等
主要仪器设备
水浴锅
生物安全柜
离心机
细胞计数仪
显微镜
细胞培养箱
操作步骤
01
PBMC复苏
（1）设置水浴锅温度为37℃，待温度稳定后，从液氮中取出冻存的PBMC，在水浴锅中快速摇动，至冰晶完全融化。
（2）在生物安全柜中向15mL离心管中加入10mL D-PBS或PBS，将融化的PBMC冻存液转移到含有D-PBS或PBS的离心管中，室温，离心。将免疫细胞培养基取出，平衡至室温。
（3）离心完成后，弃上清，以1-3mL免疫细胞培养基重悬细胞，进行计数。调整细胞浓度至合适浓度，转移到培养瓶中，恢复过夜。
02
PBMC中T细胞激活
为对CD3抗体的最适浓度进行激活验证，6孔板设计如下图1所示。激活条件确定后，可仅保留共激活组和未激活组。
图1.实验中6孔板排板。α-CD28：anti-CD28 antibody，后同。X：参考值，见参考资料；Y：参考值，Y<Z<T。
（1）将CD3及CD28抗体制备为母液。
（2）分别使用2mL D-PBS（或PBS）将CD3抗体稀释为Y、Z、Tμg/mL的工作液（见参考资料），加入到图1所示的1号、2号、3号孔中，其余孔中加入2mL的D-PBS（或PBS）。将6孔板置于细胞培养箱中静置2h，对6孔板进行抗体包被。
（3）收集复苏的PBMC细胞，使用免疫细胞培养基重悬细胞，调整其细胞浓度为参考值。
（4）取2mL上述PBMC细胞悬液，备用。另外取8mL 上述PBMC细胞悬液，转移到15mL离心管中，加入终浓度为Xμg/mL的CD28抗体，颠倒混匀，实现CD28抗体与PBMC共孵育。
（5）待6孔板包被完成后，将其中的液体吸弃。如图1所示，将与CD28抗体共孵育的PBMC悬液2mL，分别分配至1-4号孔中；将2mL备用的PBMC细胞悬液，分配至5号孔中；将无细胞的免疫细胞培养基2mL分配到6号孔中，作为空白对照。
（6）将6孔板转移至培养箱中，培养3天。
03
T细胞激活检测
（1）分别取图1中各孔的上清。
（2）按照IFN-γ ELISA检测试剂盒说明书进行T细胞激活情况检测。
04
T细胞培养
（1）根据说明书，对IL-2的质量与IU进行转换。配制IL-2母液。
（2）向免疫细胞培养基中加入合适浓度的IL-2，配制成完全培养基，即可对T细胞进行培养扩增，用于后续实验。
主要结果
01
T细胞激活后镜下观可见大量细胞团生成
未激活组的PBMC多数呈现单细胞状态，而激活组的PBMC中，T细胞发生增殖，形成大量细胞团。细胞团呈现不贴壁或轻微贴壁状态，可经过轻轻吹打分散成单细胞。
图2.未激活组与激活组PBMC细胞状态镜下观
02
T细胞激活后，IFN-γ分泌量显著增加
图3. T细胞激活后，IFN-γ分泌量显著增加
左：ELISA试剂盒标准曲线
右：检测结果
从ELISA结果可见，在本次检测中共激活组IFN-γ分泌量显著增加。值得注意的是，随着CD3抗体的浓度增加，IFN-γ分泌量并未上升。在设置的组别中，对PBMC激活效果以IFN-γ分泌量计，最好的是Yμg/mL。同时我们也可以看到，单独的CD28抗体，并不能有效激活T细胞。
03
T细胞培养后，细胞量显著增加，仍能继续成团
对激活的T细胞轻轻吹散，以培养基培养一周内，可见T细胞数量扩增，且细胞成团明显。扩增获得的T细胞可用于下游实验。
图4. 激活后的T细胞在培养基中成团扩增
PBMC 激活 T 细胞与类器官共培养对TCE进行药效评价
在肿瘤与自身免疫性疾病治疗领域，T细胞衔接器（T-cell engagers, TCEs）作为一种创新性的双/多特异性抗体平台，正迅速成为免疫治疗的新基石。TCE 与 ADC 的联合应用已成为临床研究的重要方向，其原理在于：ADC 杀伤高抗原表达的肿瘤细胞后释放肿瘤抗原，可进一步增强 TCE 的免疫激活效果，形成「靶向杀伤+免疫清除」的协同效应，有望显著提升客观缓解率并延长生存期。
丹望医疗通过PBMC中T细胞激活扩增、T细胞与肿瘤类器官共培养效靶比测试、T细胞与肿瘤类器官特定效靶比下共培养对TCE药效测试等三个阶段，实现了对阳性TCE药物药效的有效评价，证实了TCE对不同胃癌类器官的杀伤存在差异化响应与时效特征。
应用价值：这一发现不仅验证了PBMC作为效应细胞来源的可行性，同时也验证了丹望医疗大分子体系在TCE上的有效性，更为在类器官平台上评估TCE 与 ADC 的联合应用的药效奠定了基础。
类器官与PBMC-T cell共培养效靶比测试
图片示例：类器官，PBMC-T cell donor 1081
参考资料：
https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-center/immunology-at-work/immunology-protocols/t-cell-activation-anti-cd3-anti-cd28.html
类器官及相关试剂来源于丹望医疗
部分实验材料来源：（排名不分先后）：赛笠生物、义翘神州、华安生物、Lonza、源培生物。
作者：丹望医疗生产部
审核发布：丹望医疗市场部
