新手必备 | 流式实验3类关键注意事项
2025-03-12样本制备阶段
（1）在进行流式细胞实验时，建议使用新鲜采集的样本，无论是悬浮细胞、外周血还是实体脏器样本，以避免因时间推移导致的细胞形态改变和抗原表达下降。并且需要注意封闭样本中的Fc受体。这样可以减少非特异性结合，确保染色的准确性和可靠性，从而提高实验结果的质量。通过适当的封闭步骤，您可以有效避免抗体与Fc受体的非特异性结合，使数据分析更加精准。
（2）在流式细胞实验中，针对不同类型的蛋白质应采用相应的固定和通透方法。细胞表面蛋白可以直接标记，而胞内蛋白和核蛋白则需先进行固定和破膜处理后才能标记。对于分泌蛋白，需使用Monensin或BFA预处理，以破坏Na+、H+梯度，阻断高尔基体转运和分泌过程，使分泌蛋白滞留在细胞内。选择合适的固定和通透策略，确保抗体能够有效接近目标蛋白，从而提高染色的准确性和可靠性。
样本标记阶段
（1）在选择流式抗体时，需确保满足靶标特异性、反应种属及应用实验（如流式细胞术，FC）的基本条件。流式抗体的荧光标记方法主要有直接标记和间接标记两种。为减少实验步骤并保证结果的真实性和准确性，建议在条件允许的情况下优先使用直接标记的抗体进行实验。这样不仅可以简化操作流程，还能提高实验的可靠性和重复性。
（2）选择荧光染料时，应根据流式细胞仪的激发光和滤光片选择合适波长的荧光素。不同荧光染料的亮度有所差异，常见的排序为：PE > APC > Alexa Fluor 647 > PE-Cy7 > PerCP-Cy5.5 > Alexa Fluor 488 > FITC > APC-Cy7。在多色实验中，建议使用高亮度荧光素标记低表达蛋白，低亮度荧光素标记高表达蛋白，并尽量选择发射光谱重叠小的荧光组合，如FITC/APC，以减少背景干扰，提高数据质量。这样可以确保实验结果的准确性和可靠性。
实验对照选择
设置合理的对照组是确保流式实验成功的关键，可以有效避免假阳性和假阴性结果。流式实验中应至少包括五种对照：空白对照、同型对照、单染对照、荧光减一对照和生物学对照。这些对照有助于校准仪器、评估背景信号、确定补偿值以及验证实验设计的合理性，从而提高数据的准确性和可靠性。通过精心设置这些对照组，您可以确保实验结果的真实性和可重复性。
在进行流式细胞实验时，选择合适的抗体和荧光染料、设置恰当的对照组以及优化实验步骤都是确保成功的关键。
